Czy nowe metody regeneracji zastąpią tradycyjne terapie?
Najnowsze badania wskazują, że terapia łącząca rusztowania 3D z intraartykularnymi iniekcjami losartanu może stanowić skuteczną alternatywę dla tradycyjnych metod leczenia ubytków osteochondralnych. Jak wiadomo, chrząstka stawowa charakteryzuje się bardzo ograniczoną zdolnością regeneracyjną, a jej potencjał samoodnawiania jest znacząco ograniczony. Uszkodzenia chrzęstno-kostne zazwyczaj goją się poprzez tworzenie fibrochrząstki, tkanki słabiej zorganizowanej i mechanicznie mniej wytrzymałej niż chrząstka szklista. Fibrochrząstka wykazuje mniejszą odporność na obciążenia mechaniczne i ulega deterioracji pod wpływem powtarzających się obciążeń, co często prowadzi do rozwoju osteoartrozy.
W leczeniu ubytków chrząstki i osteochondralnych kluczowymi celami są: niski koszt, minimalna chorobowość, operacja jednofazowa, wczesna mobilizacja i długoterminowa skuteczność. Historycznie, debridement i mikrofrakturacja należały do najlepiej ugruntowanych opcji leczenia ubytków chrząstki. Jednak chrząstka powstająca w wyniku tych procedur to głównie fibrochrząstka, co wiąże się ze spadającymi wskaźnikami powodzenia w miarę upływu czasu. Z kolei przeszczep autologiczny osteochondralny (OAT) umożliwia przeniesienie żywej chrząstki szklistej z podchrzęstnym wsparciem kostnym do miejsca ubytku, dając lepsze długoterminowe wyniki w porównaniu z mikrofrakturacją. Istotną wadą autograftów osteochondralnych jest chorobowość miejsca dawczego. Dlatego też jednocylinderkowy OAT jest powszechnie akceptowanym i często stosowanym rozwiązaniem dla małych ubytków osteochondralnych (np. ubytek kłykcia udowego 9 mm z powodzeniem wypełniony 9 mm cylindrem OAT pobranym z grzebienia kłykcia przyśrodkowego).
Kluczowe aspekty nowej metody regeneracji chrząstki:
- Połączenie rusztowań 3D z dostawowymi iniekcjami losartanu oferuje alternatywę dla tradycyjnego przeszczepu autologicznego (OAT)
- Metoda jest mniej inwazyjna i nie wymaga pobierania przeszczepu
- Losartan w dawce 1 mg/staw hamuje włóknienie i promuje tworzenie chrząstki szklistej
- Terapia wykorzystuje naturalne mechanizmy regeneracyjne poprzez mobilizację mezenchymalnych komórek macierzystych
- Wyniki biomechaniczne i histologiczne są porównywalne z techniką autograftu
Jak losartan wpływa na procesy gojenia chrząstki?
Aktywność receptorów angiotensyny jest podwyższona w przerośniętej chrząstce, przyczyniając się do patogenezy osteoartrozy. Angiotensyna II stymuluje transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), który służy jako główny mediator odpowiedzialny za włóknienie. Dostawowe wstrzyknięcie TGF-β do kolan dorosłych szczurów, jak wykazano, wywołuje osteoartrozę. W innym badaniu wykazano, że usunięcie receptora TGF-β2 u dojrzałych myszy chroniło staw kolanowy przed rozwojem osteoartrozy. Ponadto to samo badanie wykazało, że doustne podawanie losartanu, blokera receptora angiotensyny II, zapobiegało rozwojowi osteoartrozy bez konieczności usuwania receptora TGF-β2.
Losartan, powszechnie stosowany jako lek przeciwnadciśnieniowy, działa jako bloker receptora angiotensyny i jest zazwyczaj podawany doustnie. W badaniu analizującym wpływ losartanu na uszkodzoną chrząstkę wykazano, że doustne podawanie losartanu promowało tworzenie chrząstki podobnej do szklistej. Jednakże, pojawiły się obawy związane z koniecznością stosowania wysokich dawek doustnych i związanymi z tym ogólnoustrojowymi działaniami niepożądanymi, przy czym hipotonia, hiperkaliemia i upośledzenie funkcji nerek są najczęstsze. W przeciwieństwie do tego, niedawne badanie wykazało, że dostawowe wstrzyknięcie losartanu promowało regenerację chrząstki o cechach podobnych do szklistej w modelu operacji mikrofrakturacji u królika. Efekt był zależny od dawki, a 1 mg na staw został zidentyfikowany jako najbardziej skuteczna dawka bez oznak stanu zapalnego czy toksyczności.
Jak przebiega eksperymentalna ocena metod naprawy osteochondralnych ubytków?
Naukowcy przeprowadzili badanie, którego celem była ocena i porównanie radiologicznych, makroskopowych, biomechanicznych i histologicznych wyników OAT oraz skafoldu wewnątrzubytowego w połączeniu z dostawowym podawaniem losartanu w modelu króliczym urazu osteochondralnego. Hipotezą badania było, że leczenie ubytków osteochondralnych w kolanach królików przy użyciu skafoldu i dostawowego wstrzyknięcia losartanu przyniesie wyniki podobne do tych uzyskanych techniką autologicznego przeszczepu osteochondralnego.
W badaniu wykorzystano 12 samic królików nowozelandzkich, w wieku 6 miesięcy, o wadze między 3 a 4 kg. Zarówno prawe, jak i lewe kolana tylne każdego królika zostały włączone do badania, z randomizacją określającą przydział leczenia dla każdej kończyny. Jedno kolano zostało przydzielone do otrzymania skafoldu w połączeniu z dostawowym wstrzyknięciem losartanu (Grupa A), podczas gdy przeciwległe kolano było leczone przeszczepem autologicznym osteochondralnym (Grupa B).
Znieczulenie wywołano przez żyłę brzeżną ucha za pomocą ksylazyny (5 mg/kg, dożylnie) i ketaminy (50 mg/kg, dożylnie), a następnie dożylnie podano profilaktycznie cefazolinę (40 mg/kg). Kończyny tylne każdego zwierzęcia ogolono, przygotowano sterylnym roztworem antyseptycznym i obłożono w sposób sterylny. Staw kolanowy zidentyfikowano przez palpację i uzyskano dostęp przez nacięcie w linii środkowej. Po nacięciu skóry i tkanki podskórnej zastosowano przyśrodkowe podejście przyprzyczepowe, z nacięciem rozciągającym się przyśrodkowo do rzepki. Następnie rzepkę przemieszczono bocznie, aby odsłonić bruzdę rzepkowo-udową.
Pełnej grubości ubytek osteochondralny o szerokości 4 mm i głębokości 4 mm wytworzono w obszarze kłykcia przy użyciu zestawu narzędzi do mozaikoplastyki. W Grupie A ubytek wypełniono rusztowaniem. Po upewnieniu się, że rusztowanie jest na równi z otaczającą zdrową chrząstką, rzepkę zreponowano, a rusztowanie odpowiednio pokryto. Następnie naprawiono mechanizm prostowniczy. Tkankę podskórną i skórę zaszyto warstwami. Roztwór losartanu (10 mg/ml) przygotowano przez rozpuszczenie 10 mg losartanu w 1 ml buforu fosforanowego (PBS) i sterylizowano przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Następnie 0,1 ml roztworu (równoważne 1 mg losartanu) wstrzyknięto dostawowo do stawu kolanowego.
W Grupie B ubytek osteochondralny naprawiono przez reimplantację fragmentu osteochondralnego, który został wcześniej usunięty, zgodnie z wcześniejszymi badaniami. Rzepkę ustawiono w odpowiedniej pozycji, a fragment osteochondralny zabezpieczono na miejscu. Naprawiono mechanizm prostowniczy, a następnie zamknięto tkankę podskórną i skórę. Zastosowano opatrunek pooperacyjny. Zwierzęta otrzymywały kontynuację profilaktyki cefazoliną przez 24 godziny po operacji i mogły swobodnie poruszać się w swoich klatkach z nieograniczonym dostępem do pożywienia i wody. W Grupie A dostawowe wstrzyknięcia 1 mg losartanu (1 ml roztworu) podawano przez podejście boczne przyprzepkowe w 2 i 4 tygodniu po operacji. Wszystkie zwierzęta obserwowano przez łącznie 6 miesięcy.
Podczas pooperacyjnego okresu obserwacji, jeden królik z Grupy B, w którym zastosowano autograft osteochondralny, rozwinął infekcję w lewym kolanie, wraz z powikłaniem w miejscu rany. Pomimo irygacji i oczyszczenia, infekcja utrzymywała się, i to kolano zostało następnie wykluczone z badania. Dodatkowo, jeden królik został całkowicie wykluczony z badania z powodu złamania kości udowej doznanego podczas procesu wbijania podczas usuwania autograftu osteochondralnego. Ponadto dwa króliki uległy powikłaniom związanym z pooperacyjnym znieczuleniem. W rezultacie, łącznie dziewięć zwierząt obserwowano do zakończenia badania po 6 miesiącach. Ostateczna analiza obejmowała dziewięć kolan w Grupie A i osiem kolan w Grupie B.
Zalety i ograniczenia badania:
- Zalety:
- Metoda bezokomórkowa, gotowa do użycia (off-the-shelf)
- Możliwość łatwej integracji z różnymi typami rusztowań
- Porównywalna skuteczność z tradycyjnymi metodami
- Ograniczenia:
- Krótki okres obserwacji
- Mała próba badawcza
- Różnice między chrząstką króliczą a ludzką
- Brak monitorowania ogólnoustrojowych efektów ubocznych losartanu
Co ujawniły badania makroskopowe, radiologiczne i biomechaniczne?
Skafoldy zostały przygotowane z roztworu zawierającego 4% alginianu, 5% żelatyny B i 1% kwasu hialuronowego. Roztwór mieszano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Następnie dodano 0,9 ml 2% roztworu CaCl₂ i odczekano pół godziny na sieciowanie żelu. Przygotowany roztwór został załadowany do strzykawki, którą następnie umieszczono w drukarce 3D. Podczas drukowania na każdą warstwę skafoldu rozpylano 15% roztwór CaCl₂. Po zakończeniu drukowania skafoldu, siedmiokrotnie w 10-minutowych odstępach rozpylano na skafold 20% roztwór CaCl₂. Skafold, który był przechowywany w +4°C przez 1 dzień, został przygotowany z 95% etanolem i 33 mM EDC-15 mM NHS następnego dnia. Skafold zanurzono w 15 ml przygotowanego roztworu. W celu przeprowadzenia procesu sieciowania skafold trzymano w roztworze w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Skafold wyjęty z pieca (37°C) został usunięty z roztworu sieciującego, a procesy sterylizacji były następujące: 10 min woda destylowana, 30 min czysty etanol, 15 min bufor fosforanowy (PBS) (pH 7,4).
W badaniu makroskopowym w obu grupach ubytki były całkowicie wygojone. W Grupie A ubytki były całkowicie zamknięte. Nowo utworzona tkanka wydawała się zintegrowana z obszarem ubytku, jednak granice pozostały rozróżnialne ze względu na kontrast tkankowy lub cechy remodelowania. Nie zaobserwowano szczeliny między regenerowaną tkanką a otaczającą natywną chrząstką. Zregenerowana chrząstka w obszarze ubytku znajdowała się na tym samym poziomie co sąsiednia zdrowa chrząstka. Z kolei w Grupie B granice między regenerowaną a otaczającą natywną chrząstką były mniej wyraźne. Integracja między zregenerowaną chrząstką a otaczającą tkanką była całkowita. Cechy powierzchniowe, w tym kolor i tekstura, wykazywały wyższy stopień zgodności z sąsiednią chrząstką w Grupie B.
W ocenie radiologicznej (MRI) w obu grupach obszary ubytków zostały zamknięte, a ciągłość kości podchrzęstnej i chrząstki wydawała się naturalna. Powierzchnie chrząstki były gładkie, a intensywność sygnału przeszczepów była izointensywna. W obu grupach zaobserwowano obszary sygnału hiperintensywnego o różnej wielkości pod przeszczepami, szczególnie w punktach kontaktu z kością szpikową.
Próbki umieszczono w roztworze na bazie fosforanów i przechowywano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Do testów biomechanicznych próbki umieszczono na metalowej powierzchni, a cylindryczne wgłębienie (o średnicy 2 mm) przyłożono prostopadle do górnej połowy obszaru ubytku. Próbki utrzymywano w stanie wilgotnym przez cały eksperyment. Zastosowano analizator tekstury o nazwie Stable Microsystems (Instron Model 3365, Instron Engineering Corporation). Zastosowano test kompresji. Narysowano wykresy naprężenie-odkształcenie i porównano obciążenie, przy którym chrząstka i kość podchrzęstna pękały pod ciągłym ściskaniem, oraz wartości odkształcenia przy tej wartości.
Biomechanicznie nie było istotnej różnicy w maksymalnych wartościach naprężenia podczas obciążania między dwiema grupami (p = 0,088). Podobnie, maksymalne wartości odkształcenia pod obciążeniem nie wykazały statystycznie istotnej różnicy między grupami (p = 0,847).
Analizę histologiczną pozostałej nienaruszonej dolnej połowy ubytku rozpoczęto po testach biomechanicznych. Wyekstrahowane tkanki utrwalono w 10% buforowanej formalinie przez co najmniej 24 godziny w 10-krotnej jej objętości. Każdą ponumerowaną tkankę metodycznie rozcięto. Próbki obserwowano przez 12 godzin w automatycznym urządzeniu tkankowym. Następnie przekształcono je w bloki parafinowe. Z bloków parafinowych pobrano przekroje o grubości 3-4 mikronów. Po odparafinowaniu zastosowano rutynowe barwienie hematoksyliną i eozyną oraz Safraninem-0. Każdy slajd pokryto szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu entellanu. Przeprowadzono ocenę histologiczną grup i punktację histologiczną według zmodyfikowanej skali Wakitani.
W badaniu histopatologicznym nie zaobserwowano istotnej różnicy między dwiema grupami pod względem morfologii komórek (p = 0,511), barwienia macierzy Safraninem-O (p = 0,248), architektury powierzchni chrząstki (p = 0,223), grubości chrząstki (p = 0,614), integracji z sąsiednią chrząstką gospodarza (p = 0,614) i całkowitych wyników w skali Wakitani (p = 0,999). Skala Wakitani jest półilościową metodą oceny histologicznej stosowaną do oceny naprawy chrząstki. Ocenia ona parametry takie jak morfologia komórek, barwienie macierzy, regularność powierzchni, grubość chrząstki i integracja z sąsiednią tkanką.
Jakie wnioski płyną z eksperymentu i co dalej?
Głównym wnioskiem z tego badania jest to, że podejścia oparte na skafoldach, w połączeniu z dostawowym losartanem, mogą mieć obiecujący potencjał do naprawy osteochondralnej, oferując mniej inwazyjną, ale równie skuteczną alternatywę dla OAT. Wprowadza to nową granicę w terapiach bezokomórkowych opartych na skafoldach, zapewniając przyszłą perspektywę dla regeneracji chrząstki poprzez wykorzystanie losartanu jako środka przeciwfibrotycznego w celu poprawy endogennej naprawy ubytków osteochondralnych za pośrednictwem skafoldu. Analiza histologiczna nie wykazała istotnych różnic w całkowitych wynikach w skali Wakitani między grupami, sugerując, że kombinacja skafold-losartan może osiągnąć wyniki regeneracji tkanek porównywalne do technik autograftu. Pod względem biomechanicznym, wartości naprężenia i odkształcenia pod maksymalnym obciążeniem były podobne w obu grupach, podkreślając integralność strukturalną naprawionej tkanki uzyskanej za pomocą podejścia skafold-losartan. Oceny MRI i makroskopowe również nie wykazały zauważalnych różnic między grupami, dodatkowo wspierając porównywalną skuteczność losartanu w połączeniu z bezkomórkowym rusztowaniem do naprawy chrząstki. Wydaje się, że na horyzoncie leczenia ortobiologicznego wschodzi nowa gwiazda.
Oprócz technik takich jak mikrofrakturacja, autograft osteochondralny, implantacja autologicznych chondrocytów i implantacja autologicznych chondrocytów związanych z macierzą, badacze ostatnio skupili się na implantach opartych na rusztowaniach. Chociaż w badaniach na zwierzętach w literaturze donoszono o tworzeniu chrząstki podobnej do szklistej, niektóre badania kliniczne i wtórne artroskopie donoszą o tworzeniu zarówno chrząstki szklistej, jak i włóknistej. Autograft osteochondralny jest procedurą jednofazową, która promuje biologiczne gojenie, i zgłoszono, że zapewnia lepsze długoterminowe wyniki w porównaniu z techniką mikrofrakturacji. Dzieje się tak, ponieważ gojenie osiągane jest z chrząstką szklistą.
Losartan jest zatwierdzonym przez FDA lekiem przeciwnadciśnieniowym, który wywiera efekty przeciwfibrotyczne poprzez blokowanie receptorów angiotensyny II w układzie renina-angiotensyna-aldosteron. Efekt ten osiągany jest poprzez blokowanie receptorów angiotensyny II znajdujących się w ścianach naczyń. Receptory te znajdują się również w tkankach nienaczyniowych, takich jak chrząstka stawowa i tkanka maziówkowa. Po związaniu angiotensyny II z jej receptorem, szlak sygnałowy TGF-β jest aktywowany na błonie komórkowej. TGF-β jest mediatorem odpowiedzialnym za włóknienie. W badaniu na zwierzętach, po nacięciu mięśnia brzuchatego łydki, podawano doustnie bloker receptora angiotensyny, aby zablokować szlak sygnałowy TGF-β podczas gojenia tkanek. Wykazano, że włóknienie zostało zmniejszone w tej grupie. TGF-β stymuluje chondrocyty do zwiększenia syntezy kolagenu i proteoglikanów, ale także powoduje włóknienie w tkance maziówkowej i innych tkankach. Jako efekt netto, zakłóca homeostazę stawów, prowadząc do osteoartrozy. Dostawowe wstrzyknięcia TGF-β w modelach zwierzęcych doprowadziły do rozwoju osteoartrozy. Doniesiono, że nadmierna ekspresja TGF-β w kolanie myszy prowadzi do osteoartrozy i tworzenia się chrzęstno-osteofitów w tkankach maziówkowych. Podobne wyniki zaobserwowano w badaniach obejmujących dostawowe wstrzyknięcia TGF-β u ludzi. Wykazano, że doustny losartan chroni staw przed osteoartrozą u myszy z niestabilnością łąkotki. Opierając się na hipotezie, że losartan mógłby potencjalnie hamować efekty fibrotyczne TGF-β, podawano doustnie losartan królikom z ubytkami osteochondralnymi, co skutkowało zmniejszonym włóknieniem i tworzeniem chrząstki podobnej do szklistej. Aby uniknąć ogólnoustrojowych efektów ubocznych doustnego losartanu, bezpieczną i skuteczną dawkę dostawową losartanu przetestowano w kolanach królików i określono jako 1 mg.
Nasze badanie wykorzystuje połączenie rusztowań drukowanych w 3D i dostawowego wstrzyknięcia losartanu jako technikę, która nie była wcześniej badana. Technika ta ma na celu ułatwienie gojenia ubytków osteochondralnych i promowanie tworzenia chrząstki podobnej do szklistej. Nasze wyniki histologiczne wspierają tworzenie chrząstki podobnej do szklistej, zgodnie z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że dostawowy losartan w dawce 1 mg/ml poprawia naprawę chrząstki za pośrednictwem mikrofrakturacji i promuje regenerację podobną do szklistej w modelach króliczych. Ponadto, oceny biomechaniczne również przyniosły wyniki zgodne z danymi z literatury. Co więcej, uzyskano podobne wyniki histologiczne i biomechaniczne w porównaniu do OAT. Połączenie rusztowań drukowanych w 3D i losartanu oferuje kilka zalet: jest to podejście mniej inwazyjne, które nie wymaga pobierania przeszczepu, jest bezkomórkowe i opiera się na endogennej naprawie poprzez mobilizację mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) ze szpiku kostnego i tkanki maziówkowej, wraz z migracją obwodowych chondrocytów. Ponadto, ze względu na łatwą integrację z różnymi typami rusztowań, ma potencjał, aby służyć jako klinicznie stosowalna i łatwo dostępna (off-the-shelf) opcja terapeutyczna. Wcześniejsze badania wykazały, że czynniki biologiczne, takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), mogą zwiększać mobilizację MSC; dlatego G-CSF mógłby potencjalnie zostać zintegrowany z tym modelem leczenia, aby dalej promować regenerację.
To badanie ma kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników. Po pierwsze, nie mierzono poziomów losartanu we krwi i moczu, ani nie monitorowano pooperacyjnych parametrów życiowych, takich jak ciśnienie krwi, co ogranicza ocenę potencjalnych ogólnoustrojowych efektów ubocznych. Dodatkowo, istnieją nieodłączne różnice między chrząstką królicką a ludzką pod względem struktury i zdolności gojenia, co może wpływać na możliwość przeniesienia tych wyników do praktyki klinicznej. Innym ograniczeniem jest używanie obu kolan do interwencji u tego samego zwierzęcia. W praktyce klinicznej zazwyczaj leczy się tylko jedno kolano, a procedury obustronne mogą upośledzać normalną pooperacyjną rekonwalescencję ze względu na ograniczenia funkcjonalne. Okres obserwacji w tym badaniu był stosunkowo krótki, potencjalnie ograniczając wgląd w długoterminowe efekty naprawy chrząstki. Ponadto, użycie małej próby, powszechne w badaniach na zwierzętach, może ograniczać możliwość uogólnienia wyników. Warto również zauważyć, że procedura OAT w tym badaniu była reimplantacją tego samego cylindra osteochondralnego, a nie prawdziwym autograftem pobranym z oddzielnego miejsca dawczego. W rezultacie nie było chorobowości miejsca dawczego w Grupie B, co mogło wprowadzić pozytywne odchylenie w kierunku lepszego gojenia w tej grupie. Jednakże, ten wybór projektowy ustanowił również spójną podstawę między grupami poprzez wyeliminowanie powikłań miejsca dawczego w obu, tym samym poprawiając równowagę do analizy porównawczej. Wreszcie, brak grupy kontrolnej w celu izolacji i oceny specyficznych efektów samego losartanu stanowi ważne ograniczenie.
Badanie to podkreśla przełomową koncepcję terapeutyczną łączącą drukowanie 3D wewnątrzubytowych skafoldów z dostawowymi wstrzyknięciami losartanu, która może na nowo zdefiniować przyszłość naprawy osteochondralnej. Oferując mniej inwazyjne, bezokomórkowe rozwiązanie gotowe do użycia, to innowacyjne podejście nie tylko dorównuje biomechanicznym i histologicznym wynikom technik autograftu, ale także otwiera nową erę w regeneracji chrząstki. Dzięki zdolności do wykorzystania endogennych mechanizmów naprawczych i potencjalnej adaptowalności do różnych scenariuszy klinicznych, strategia ta jawi się jako transformacyjny i obiecujący kierunek w leczeniu ortobiologicznym.
Podsumowanie
Przeprowadzone badanie wykazało, że terapia łącząca rusztowania 3D z dostawowymi iniekcjami losartanu może stanowić skuteczną alternatywę dla autologicznego przeszczepu osteochondralnego (OAT) w leczeniu ubytków chrząstki. W eksperymencie na królikach porównano dwie metody: grupę otrzymującą skafold z losartanem oraz grupę leczoną przeszczepem autologicznym. Wyniki badań makroskopowych, radiologicznych, biomechanicznych i histologicznych nie wykazały istotnych różnic między obiema grupami. Nowa metoda oferuje mniej inwazyjne podejście, nie wymaga pobierania przeszczepu i opiera się na endogennej naprawie poprzez mobilizację mezenchymalnych komórek macierzystych. Losartan, działając jako bloker receptora angiotensyny II, hamuje włóknienie i promuje tworzenie chrząstki podobnej do szklistej. Połączenie rusztowań 3D z losartanem może stanowić przełom w regeneracji chrząstki, oferując gotowe do użycia, bezokomórkowe rozwiązanie terapeutyczne.
