Losartan + ekstrakt z liści oliwnych w FSGS: szlak Klotho/Wnt4

Ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS) stanowi około 40% przypadków zespołu nerczycowego u dorosłych i 20% u dzieci, prowadząc do postępującego bliznowacenia kłębuszków, proteinurii i niewydolności nerek. Model eksperymentalny FSGS indukowany adriamycyną (ADR) u szczurów adekwatnie odwzorowuje cechy patofizjologiczne choroby u ludzi – masywną proteinurię, glomerulosklerozę oraz śródmiąższowe zapalenie i włóknienie.

Nadciśnienie tętnicze i proteinuria to główne czynniki ryzyka progresji FSGS. Kluczową rolę w patogenezie uszkodzenia kłębuszków odgrywa obniżona produkcja tlenku azotu (NO), związana z rozwojem i postępem różnych modeli przewlekłej choroby nerek (CKD). Jednocześnie białko Klotho – obiecujący wczesny biomarker uszkodzenia nerek – ulega znacznej supresji w CKD, gdzie przewiduje progresję i powikłania choroby. Klotho działa ochronnie poprzez bezpośrednie wiązanie różnych białek Wnt, prowadząc do zahamowania aktywacji miofibroblastów i włóknienia.

Blokada receptora angiotensyny II typu 1 (AT1-R) losartanem poprawia ciśnienie krwi i funkcję nerek u szczurów z FSGS indukowanym ADR, jednak nie eliminuje całkowicie uszkodzenia narządu. Tempol – syntetyczny antyoksydant działający jako naśladowca dysmutazy ponadtlenkowej – wykazuje działanie hipotensyjne i nefroochronne w różnych modelach chorób nerek. Z kolei ekstrakty roślinne, szczególnie z liści oliwnych (Olea europaea L.), bogate w związki fenolowe jak oleuropeina i hydroksytyrozol, wykazują działanie antyoksydacyjne, hipotensyjne i przeciwmiażdżycowe.

Dotychczas brakuje badań oceniających skuteczność leczenia losartanem uzupełnionego ekstraktem z liści oliwnych w eksperymentalnej CKD. Hipoteza badawcza zakładała, że terapia losartanem w kombinacji z antyoksydantami – syntetycznym (tempol) lub naturalnym (ekstrakt z liści oliwnych) – może być skuteczniejsza w zapobieganiu procesom związanym z postępującym uszkodzeniem nerek.

Jak zaprojektowano eksperyment oceniający terapie kombinowane?

Badanie przeprowadzono na samicach szczurów spontanicznie nadciśnieniowych (SHR) w wieku 6 miesięcy, o masie ciała 180-200 g. Zwierzęta podzielono losowo na pięć grup. Nefropatię adriamycynową indukowano w czterech grupach przez dożylne podanie adriamycyny w dawce 2 mg/kg masy ciała, dwukrotnie w odstępie 21 dni. Szczury z grupy kontrolnej (SHC) otrzymywały sól fizjologiczną.

Po drugiej iniekcji grupy kontrolna i modelowa (SHADR) otrzymywały wodę z kranu, natomiast grupy SHADR+L, SHADR+L+T i SHADR+L+O otrzymywały przez zgłębnik przez 6 tygodni odpowiednio: losartan (10 mg/kg/dzień), losartan + tempol (10 + 100 mg/kg/dzień) oraz losartan + ekstrakt z liści oliwnych (10 + 80 mg/kg/dzień). Zastosowany ekstrakt z liści oliwnych (Benolea® EFLA®943) był standaryzowany do zawartości 17% oleuropeiny i 40,5% całkowitych polifenoli.

Po zakończeniu leczenia mierzono parametry hemodynamiczne (ciśnienie tętnicze średnie, przepływ krwi w aorcie), pobierano próbki krwi i tkanek nerkowych. Oceniano funkcję nerek (stężenia albuminy i kreatyniny w osoczu i moczu, stosunek białko/kreatynina w moczu), markery stresu oksydacyjnego (TBARS, zdolność antyoksydacyjna metodą ABTS), aktywność enzymów antyoksydacyjnych (SOD, katalaza, GPx), poziomy NOx oraz ekspresję białek (6-nitrotryptofan, Klotho, Wnt-4, β-katenina, PAI-1, fibronektyna) metodą Western blot. Wykonano badanie histopatologiczne z oceną zmian kłębuszkowych i śródmiąższowych w skali punktowej.

Jak terapie kombinowane wpłynęły na funkcję i strukturę nerek?

Średnie ciśnienie tętnicze w grupie modelowej nie różniło się od kontroli, jednak wszystkie leczenie znacząco je obniżyły w porównaniu z grupą SHADR. Stężenie kreatyniny w osoczu było istotnie podwyższone w grupie SHADR w porównaniu z kontrolą. Tylko losartan i L+O indukowały znaczącą redukcję kreatyniny względem grupy modelowej. Stężenie albuminy w osoczu było istotnie obniżone w grupie modelowej, a jedynie losartan i L+O znacząco je zwiększyły.

Wartości Up/cr, Pexc i Albexc były istotnie podwyższone w grupie modelowej. Wszystkie leczenia znacząco zmniejszyły Up/cr i Pexc w porównaniu z grupą SHADR, przy czym najsilniejszą redukcję utraty białka osiągnięto po leczeniu L+O. Albexc zmniejszyło się istotnie tylko po leczeniu losartanem i L+O, osiągając poziomy nieróżniące się istotnie od grupy kontrolnej.

Badanie histopatologiczne preparatów barwionych PAS wykazało w nerkach szczurów SHADR zaawansowaną glomerulosklerozę z przyleganiem kępki kłębuszka do pogrubiałej torebki Bowmana, rozszerzenie kanalików, zanik nabłonka kanalikowego oraz naciek komórek jednojądrowych i włóknienie śródmiąższowe. Po leczeniu losartanem obserwowano umiarkowane zmiany kłębuszkowe z morfologicznie dobrze zachowanym kompartmentem śródmiąższowym. W grupie SHADR+L+T stwierdzono zaawansowaną segmentalną glomerulosklerozę z przyleganiem do torebki oraz podobny stopień zmian śródmiąższowych jak w grupie modelowej. W grupie SHADR+L+O znaleziono jedynie łagodny wzrost macierzy mezangialnej w kłębuszkach i dobrze zachowane śródmiąższu.

Punktacja uszkodzenia nerek ujawniła, że glomeruloskleroza i uszkodzenia śródmiąższowe były istotnie zwiększone u szczurów SHADR w porównaniu z kontrolą. Leczenie losartanem znacząco zmniejszyło uszkodzenie nerek w porównaniu z grupą modelową, jednak wynik pozostał istotnie wyższy niż w grupie kontrolnej. Leczenie L+T nie wywołało żadnej istotnej poprawy zmian strukturalnych. Natomiast leczenie L+O istotnie złagodziło zmiany histopatologiczne w nerkach w porównaniu zarówno z grupą modelową, jak i SHADR+L+T, redukując uszkodzenie do poziomu nieróżniącego się istotnie od grupy kontrolnej.

Barwienie trichromem Massona wykazało w grupie kontrolnej prawidłowe rozmieszczenie delikatnych włókien kolagenowych w torebkach Bowmana kłębuszków. Grupa modelowa wykazywała rozległą akumulację włókien kolagenowych w kłębuszkach, w obrębie pogrubiałej torebki Bowmana i między kanalikiami nerkowymi. Po leczeniu losartanem obserwowano umiarkowane odkładanie włókien kolagenowych w kłębuszkach i śródmiąższu. Szczury otrzymujące L+T wykazywały wyraźną akumulację kolagenu w kłębuszkach, w obrębie pogrubiałej torebki Bowmana i między kanalikiami. Natomiast szczury leczone L+O wykazywały jedynie łagodne odkładanie kolagenu w kłębuszkach i śródmiąższu nerek.

Czy antyoksydanty wpłynęły na równowagę oksydoredukcyjną?

Peroksydacja lipidów w osoczu szczurów SHADR była istotnie zwiększona w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Leczenie losartanem lub terapia kombinowana L+T znacząco zmniejszyły peroksydację lipidów w porównaniu z grupą modelową. Peroksydacja lipidów w osoczu została zmniejszona o 30% po leczeniu L+O, osiągając poziom nieróżniący się istotnie od grupy kontrolnej.

Poziom ABTS w osoczu szczurów z grupy modelowej był istotnie obniżony w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Zdolność antyoksydacyjna osocza została przywrócona po wszystkich leczeniach. W homogenatach nerek szczurów SHADR poziomy ABTS były również istotnie obniżone; jednak nerkowa zdolność antyoksydacyjna była istotnie zwiększona po leczeniu L i L+T w porównaniu z grupą modelową.

Aktywności SOD i GPx w nerkach szczurów SHADR były istotnie obniżone w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Leczenie samym losartanem przywróciło aktywności obu enzymów do poziomu kontrolnego. Kombinowane leczenie L+T istotnie zwiększyło aktywności SOD i GPx w porównaniu z modelem; jednak aktywność GPx pozostała istotnie niższa niż w grupie kontrolnej. Po leczeniu L+O aktywność SOD wzrosła do poziomu nieróżniącego się istotnie od grupy kontrolnej, podczas gdy aktywność GPx pozostała istotnie zmniejszona. Natomiast istotny wzrost aktywności katalazy w porównaniu z wartością kontrolną zaobserwowano tylko po leczeniu L+T.

Jakie zmiany molekularne towarzyszyły efektom terapeutycznym?

Całkowita zawartość NOx była istotnie zmniejszona w nerkach szczurów SHADR, wraz z istotnym spadkiem poziomu azotanów (NO₃⁻) w porównaniu z kontrolą. Leczenie samym losartanem lub w połączeniu z O (L+O) przywróciło poziomy NOx do wartości obserwowanych u szczurów kontrolnych. Natomiast leczenie L+T wywołało istotny wzrost poziomu azotynów (NO₂⁻) w nerkach, skutkując odpowiednim podwyższeniem całkowitej zawartości NOx w porównaniu z grupą modelową.

Ekspresja białka 6-nitrotryptofanu była istotnie obniżona w nerkach szczurów SHADR w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Leczenie samym losartanem lub w kombinacji z O (L+O) istotnie zwiększyło ekspresję 6-nitrotryptofanu względem grupy modelowej; jednak poziomy pozostały istotnie niższe niż obserwowane w grupie kontrolnej. Natomiast leczenie L+T nie wywołało istotnej zmiany tego parametru w porównaniu z grupą modelową.

Ekspresja białka Klotho wykazywała trend podobny do 6-nitrotryptofanu. Ekspresja białka Klotho była istotnie zmniejszona w nerkach szczurów SHADR w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Leczenie samym losartanem lub w kombinacji z O (L+O) istotnie zwiększyło poziom Klotho w porównaniu z grupą modelową. Leczenie L+O wywołało istotnie silniejszy efekt naprawczy niż sam losartan (relatywna gęstość optyczna Klotho w SHADR+L+O: 1,03 ± 0,03 vs SHADR+L: 0,80 ± 0,02, p<0,01). Natomiast leczenie L+T nie zmieniło istotnie ekspresji białka Klotho w porównaniu z grupą modelową.

Ekspresja białka Wnt4 była istotnie zmniejszona w nerkach szczurów modelowych w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. Leczenie samym losartanem lub w kombinacji z O (L+O) istotnie zwiększyło ekspresję białka Wnt4, przywracając ją do poziomu kontrolnego. Natomiast leczenie L+T nie wywołało istotnej zmiany ekspresji białka Wnt4 względem grupy modelowej.

Ekspresja białka β-kateniny była istotnie zwiększona w grupie modelowej w porównaniu z grupą kontrolną. Leczenie samym losartanem nie wpłynęło istotnie na poziomy β-kateniny, podczas gdy leczenie L+T wywołało dalszy istotny wzrost w porównaniu zarówno z grupą modelową, jak i SHADR+L. Natomiast tylko leczenie L+O istotnie zmniejszyło ekspresję białka β-kateniny względem grupy modelowej, przywracając ją do poziomu kontrolnego.

Ekspresja białka PAI-1 była istotnie podwyższona w nerkach szczurów modelowych w porównaniu z kontrolami. Leczenie L i L+T istotnie zmniejszyło ekspresję PAI-1 do poziomu kontrolnego. Odwrotnie, leczenie L+O wywołało istotny wzrost ekspresji białka PAI-1 w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami eksperymentalnymi.

W nerkach szczurów SHADR ekspresja fibronektyny była istotnie zwiększona w porównaniu ze szczurami kontrolnymi. W przeciwieństwie do leczenia L i L+T, tylko L+O istotnie zmniejszyło ekspresję białka fibronektyny w porównaniu z grupą modelową, chociaż poziom pozostał istotnie wyższy niż u szczurów kontrolnych.

Jaki szlak sygnałowy odpowiada za działanie nefroochronne?

Ekspresja białka Klotho była istotnie zmniejszona w nerkach szczurów SHADR 6 tygodni po podaniu ADR. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, utrata Klotho stanowi wspólną cechę patologiczną uszkodzenia nerek niezależnie od etiologii. Wykazano ścisły związek między niedoborem Klotho a silną indukcją β-kateniny w kanalikach w nefropatii ADR. Nasze wyniki są zgodne z tymi obserwacjami.

β-katenina jest głównym wewnątrzkomórkowym mediatorem kanonicznego sygnalizowania Wnt i prowadzi do aktywacji profibrogenetycznego szlaku sygnałowego, który ma kluczowe znaczenie w regulacji transkrypcyjnej genów PAI-1 i fibronektyny. Zgodnie z tym, wraz ze zwiększoną ekspresją β-kateniny, zaobserwowaliśmy również istotną nadekspresję białek PAI-1 i fibronektyny w nerkach szczurów SHADR. Podwyższone poziomy PAI-1 promują rekrutację komórek zapalnych i akumulację macierzy zewnątrzkomórkowej, co jest zgodne z naciekiem komórek jednojądrowych śródmiąższowych i włóknieniem obserwowanym w tym badaniu.

Klotho funkcjonuje jako endogenny antagonista Wnt poprzez wiązanie wielu ligandów Wnt, w tym Wnt1, Wnt4 i Wnt7a, skutecznie hamując aktywację β-kateniny zależną od Wnt w komórkach nabłonka kanalikowego w nefropatii ADR. Co istotne, zaobserwowaliśmy istotne zmniejszenie ekspresji białka Wnt4 w nerkach szczurów SHADR, które zbiegło się z niedoborem Klotho, ciężką hipoalbuminemią i istotną albuminurią. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami wykazującymi pozytywną korelację między ekspresją genu WNT4 a albuminemią oraz jego negatywną korelację z albuminurią u pacjentów z FSGS.

Pomimo zmniejszenia ekspresji Wnt4, wykryliśmy silną indukcję sygnalizowania β-kateniny w nerkach szczurów SHADR, wskazując na dominującą aktywację kanonicznego, a nie niekanonicznego sygnalizowania Wnt. Chociaż nie mierzyliśmy kanonicznych genów docelowych Wnt, znaleźliśmy zwiększoną ekspresję białek PAI-1 i fibronektyny w nerkach, co jest zgodne z wynikami innego badania. Autorzy wykazali, że nawet przy zmniejszonej ekspresji białka Wnt4 w nerkach myszy Wnt4 knockout po UUO (zmniejszona o 93% w porównaniu z myszami kontrolnymi po UUO), sama stabilizacja β-kateniny była wystarczająca do indukcji różnicowania miofibroblastów w pericytach śródmiąższowych i fibroblastach po UUO. Razem wzięte, te odkrycia sugerują, że w nefropatii indukowanej ADR nadekspresja innych ligandów Wnt w uszkodzonej nerce może kompensować zmniejszoną ekspresję Wnt4 i podtrzymywać aktywację β-kateniny, tym samym napędzając progresję włóknienia u szczurów SHADR.

Przewlekła blokada receptora AT-1 losartanem istotnie zwiększyła ekspresję Klotho i przywróciła poziomy białka Wnt4. Te odkrycia ilustrują, że losartan może stymulować naprawę tkanki nerkowej po urazie poprzez inicjowanie ponownej ekspresji Wnt4, procesu zaangażowanego w przywracanie prawidłowej struktury uszkodzonego nabłonka kanalikowego. Ponowna ekspresja Wnt4 została zaobserwowana w proliferujących komórkach nabłonka kanalika proksymalnego podczas fazy naprawy po jednostronnym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym, co sugeruje, że Wnt4 odgrywa ważną rolę w regulacji progresji cyklu komórkowego podczas regeneracji kanalikowej i rekonstrukcji uszkodzonego nabłonka kanalikowego.

Nasze wyniki pokazały, że leczenie losartanem w połączeniu z naturalnym antyoksydantem może prowadzić do dodatkowego zmniejszenia fibrogenezy i poprawy struktury nerek – piszą autorzy badania. W nerkach szczurów SHADR+L znaleźliśmy również zmniejszoną ekspresję białka PAI-1 bez towarzyszących zmian w ekspresji β-kateniny, wskazując, że obniżenie PAI-1 w tym kontekście występuje niezależnie od szlaku zależnego od β-kateniny.

Z drugiej strony, leczenie L+T nie poprawiło ekspresji Klotho i Wnt4 w nerkach, jednocześnie stymulując nadekspresję β-kateniny, która była około dwukrotnie wyższa w porównaniu ze szczurami modelowymi. Ta wyraźna nadekspresja β-kateniny była zgodna z jej stabilizacją i towarzyszyła jej zwiększona ekspresja genów związanych z włóknieniem, takich jak fibronektyna. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wykazującymi, że utrzymująca się aktywacja β-kateniny napędza sygnalizowanie fibrogenne w urazie nerek. Co ważne, sama stabilizacja β-kateniny okazała się wystarczająca do indukcji różnicowania miofibroblastów w pericytach śródmiąższowych i fibroblastach we włóknieniu nerek.

Wcześniejsze badanie wykazało ważną rolę Klotho w łagodzeniu uszkodzenia nerek i osłabianiu włóknienia nerek w nefropatii ADR. Klotho hamuje aktywację β-kateniny w nerkach i obniża ekspresję jego genów docelowych, tym samym hamując aktywację miofibroblastów, zmniejszając ekspresję macierzy i łagodząc włóknienie nerek. W naszym badaniu leczenie L+O istotnie zwiększyło ekspresję Klotho, co było wystarczające do stłumienia sygnalizowania β-kateniny i w konsekwencji do zapobiegania śródmiąższowemu odkładaniu fibronektyny i kolagenu. Te zmiany molekularne były związane z istotnym złagodzeniem zmian włóknistych w nerkach i silną poprawą funkcji nerek u szczurów SHADR+L+O.

Co oznaczają te wyniki dla praktyki nefrologicznej?

Badanie wykazało, że leczenie losartanem w połączeniu z ekstraktem z liści oliwnych (naturalny antyoksydant) może prowadzić do dodatkowego zmniejszenia fibrogenezy i poprawy struktury nerek – zredukowania glomerulosklerozy, stanu zapalnego śródmiąższowego i włóknienia – do stopnia nieróżniącego się istotnie od kontroli. Mechanizm tego działania obejmuje modulację szlaku Klotho/Wnt4/β-katenina/fibronektyna.

Kluczowym odkryciem jest wykazanie, że przywrócenie ekspresji Klotho (zwiększenie o 29% w porównaniu z monoterapią losartanem) było wystarczające do stłumienia aktywacji β-kateniny i zapobiegania odkładaniu fibronektyny i kolagenu w nerkach. Jednocześnie normalizacja produkcji NO oraz przywrócenie ekspresji Wnt4 sugerują stymulację mechanizmów naprawczych przez leczenie L+O.

Interesujące jest, że kombinacja losartan+tempol (syntetyczny antyoksydant) nie przyniosła korzyści strukturalnych, mimo działania antyoksydacyjnego. Prawdopodobnie wynikało to z zaburzenia równowagi enzymów antyoksydacyjnych i możliwej nadprodukcji nadtlenku wodoru oraz nadtlenoazotynów, co paradoksalnie nasilało uszkodzenie tkanek. Podkreśla to znaczenie zachowania fizjologicznej równowagi oksydoredukcyjnej zamiast prostego wzmacniania pojedynczych elementów obrony antyoksydacyjnej.

Wyniki te są obiecujące eksperymentalnie, jednak autorzy podkreślają konieczność przeprowadzenia kontrolowanych badań klinicznych przed jakimikolwiek rekomendacjami dotyczącymi dodawania ekstraktu z liści oliwnych do terapii losartanem u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Potrzebne są również dane dotyczące długoterminowego bezpieczeństwa tej kombinacji oraz optymalizacja dawkowania u ludzi.