Losartan i fisetyna – nowa nadzieja w regeneracji kości

Czy regeneracja kości otwiera nowe perspektywy?

Badania nad regeneracją kości stanowią istotny obszar zainteresowania współczesnej medycyny, szczególnie w kontekście starzejącej się populacji i rosnącej liczby przypadków osteoporozy oraz złamań kości. W najnowszym badaniu naukowcy skupili się na analizie synergistycznego działania dwóch substancji – losartanu i fisetyny – na komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego (BM-MSCs), poszukując skutecznej metody poprawy potencjału regeneracyjnego tych komórek.

Komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego są obiecującym źródłem dla medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej ze względu na ich zdolność do różnicowania się w kierunku różnych linii komórkowych, w tym osteoblastów i adipocytów. Jednak w procesie starzenia oraz podczas ekspansji komórkowej in vitro dochodzi do nagromadzenia komórek senescencyjnych, co negatywnie wpływa na ich potencjał regeneracyjny. Zjawisko to ma szczególne znaczenie w kontekście chorób związanych z wiekiem, takich jak osteopenia i osteoporoza, gdzie obserwuje się zmniejszoną gęstość mineralną kości oraz zwiększoną infiltrację tkanki tłuszczowej w szpiku kostnym. Proces ten może wynikać z preferencyjnego przełączania MSC z osteogenezy w kierunku adipogenezy.

W omawianym badaniu naukowcy skoncentrowali się na dwóch substancjach o potencjalnym działaniu odmładzającym komórki. Losartan, selektywny bloker receptora angiotensyny II, zatwierdzony przez FDA do leczenia nadciśnienia, wykazuje obiecujące działanie w redukcji zwłóknienia oraz eliminacji komórek senescencyjnych. Fisetyna, naturalnie występujący flawonoid obecny w różnych owocach i warzywach, zyskała uwagę jako potencjalny środek senolityczny o właściwościach przeciwstarzeniowych, przeciwutleniających, przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych. Wcześniejsze badania sugerowały, że fisetyna może promować różnicowanie osteogeniczne i mineralizację BM-MSCs, jednocześnie hamując adipogenezę.

Badacze wykorzystali ludzkie BM-MSCs zakupione od ATCC, które były hodowane w mediach wzrostowych zawierających DMEM o niskiej zawartości glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Wiek dawców wynosił od 19 do 35 lat, a w badaniu wykorzystano komórki od trzech kobiet i jednego mężczyzny. Komórki były pasażowane do 4 razy, a do eksperymentów używano komórek z pasażu 5.

Czy odpowiednie dawki eliminują senescencję komórkową?

Naukowcy najpierw przeprowadzili badanie zależności dawka-odpowiedź, aby określić potencjalną toksyczność obu substancji stosowanych osobno lub w kombinacji. Losartan testowano w niskiej (23,6 μM) i wysokiej (236,5 μM) dawce, podczas gdy fisetynę badano również w dawce niskiej (50 μM) i wysokiej (100 μM). Komórki były traktowane przez 24 godziny, po czym przepłukiwano je i dodawano standardowe medium kontrolne. Żywotność komórek oceniano przy użyciu odczynnika PrestoBlue Cell Viability Reagent. Wyniki wykazały, że wysoka dawka losartanu znacząco zmniejszała żywotność BM-MSCs, natomiast komórki dobrze tolerowały fisetynę nawet w dawce 100 μM, a toksyczność obserwowano dopiero przy dziesięciokrotnie większej dawce (1000 μM).

W kolejnym etapie badacze ocenili wpływ obu substancji na senescencję komórkową. Wykorzystano do tego cytometrię przepływową z zastosowaniem związku C12FDG, który fluoryzuje po hydrolizie przez wewnątrzkomórkową β-galaktozydazę związaną z senescencją. Dodatkowo przeprowadzono barwienie SAHF (ogniska heterochromatyny związane z senescencją) z wykorzystaniem markerów γH2AX i H3K9me3. Fosforylacja seryny na reszcie 139 wariantu histonu H2AX, tworząca γH2AX, jest powszechnym markerem senescencji komórkowej i wysoce czułym markerem molekularnym uszkodzeń DNA i skracania telomerów w odpowiedzi na indukcję pęknięć dwuniciowych. H3K9me3 jest kolejnym markerem związanym z heterochromatyną, który trimetyluje histon H3, powodując epigenetyczną modyfikację pakowania DNA.

W grupie kontrolnej średnio 35 ± 7% komórek było pozytywnych dla γH2AX i podobnie 37 ± 13% komórek było pozytywnych dla H3K9me3. Mniej komórek było podwójnie pozytywnych dla γH2AX i H3K9me3, ze średnią 24 ± 8% u czterech różnych dawców BM-MSC. Zarówno fisetyna, jak i losartan w niskich dawkach, samodzielnie lub w kombinacji, znacząco zmniejszały odsetek komórek senescencyjnych w porównaniu z grupą kontrolną, choć nie zaobserwowano istotnych różnic między poszczególnymi grupami leczenia.

Czy losartan i fisetyna zmieniają równowagę osteogenezy i adipogenezy?

Terapia kombinowana losartanem i fisetyną prowadziła również do znacznego zmniejszenia ekspresji genu IL-1β, co potwierdza przeciwzapalny efekt tych substancji. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w ekspresji genów IL6 lub TGF-β między grupami leczenia a grupami kontrolnymi bez leczenia, być może ze względu na duże różnice w niektórych grupach leczenia pomimo dużej liczby powtórzeń (N > 8). W literaturze wykazano, że losartan zmniejsza produkcję prozapalnych cytokin TNFα, IL-1β i IL-6, natomiast fisetyna, jako polihydroksyflawonoid, wykazuje wielokierunkowe działanie przeciwzapalne i przeciwutleniające poprzez hamowanie szlaków PI3 kinazy, NF-κB i RAS.

Najistotniejszym odkryciem badania był wpływ losartanu i fisetyny na potencjał osteogeniczny BM-MSCs. Różnicowanie BM-MSC przeprowadzono przy użyciu zestawów Lonza Osteogenic i Adipogenic zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki były hodowane do osiągnięcia 70-90% konfluencji przy użyciu normalnego medium wzrostowego BM-MSC, a następnie traktowane niską dawką losartanu i/lub fisetyny przez 24 godziny. Dla różnicowania osteogenicznego, świeże medium indukcyjne Lonza było dodawane co 3 dni przez łącznie 15 dni. Dla różnicowania adipogenicznego, medium indukcyjne Lonza było dodawane przez 3 dni, a następnie przez 2 dni stosowano medium podtrzymujące Lonza. Proces ten powtarzano przez łącznie 15 dni.

Zamiast hamować osteogenezę, dawka 23,6 μM losartanu znacząco ją wzmacniała, co potwierdzono barwieniem Alizarin Red oraz analizą ekspresji genów. Wszystkie terapie prowadziły do statystycznie wyższej ekspresji wczesnych genów osteogenicznych, fosfatazy alkalicznej (ALP) i kolagenu typu 1A (col1A1), ale nie późniejszego genu osteogenicznego osteokalcyny (OC). Mechanistycznie, losartan działa na wielu poziomach: zwiększa proliferację osteoblastów, podnosi ekspresję kluczowych programów osteogenicznych, w tym czynnika transkrypcyjnego związanego z Runt-2 (RUNX2), fosfatazy alkalicznej i osteokalcyny, co przyczynia się do przyspieszonego przerostu chondrocytów i zwiększonego odkładania minerałów. Dodatkowo, losartan hamuje indukowaną przez RANKL fosforylację ERK1/2, prowadząc do zmniejszenia osteoklastogenezy i synergistycznej poprawy masy kostnej.

Fisetyna również wykazuje pozytywny wpływ na zdrowie kości poprzez stymulację szlaku sygnałowego Wnt/β-kateniny w preosteoblastach oraz hamowanie różnicowania osteoklastów poprzez obniżenie sygnalizacji NFATc1. Co istotne, zwiększona osteogeneza w badaniu nie wiązała się ze wzrostem adipogenezy. Reprezentatywne obrazy barwienia Oil Red O dla każdej grupy leczenia i ilościowy test Oil Red O nie wykazały żadnych istotnych różnic między wszystkimi grupami. Nie zaobserwowano również znaczącej zmiany w ekspresji genów żadnego z programów adipogenicznych: białka wiążącego kwasy tłuszczowe 4 (FABP4), receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów γ (PPARγ) i białka wiążącego wzmacniacz CCAAT (CEBP).

Czy wyniki badań przybliżą nowe podejścia terapeutyczne?

Badanie to odkryło regeneracyjne zastosowanie kombinacji losartanu i fisetyny w niskich dawkach, które działają synergistycznie, promując potencjał różnicowania osteogenicznego BM-MSCs bez zwiększania ich różnicowania adipogenicznego. Substancje te zmniejszają również senescencję komórkową i ekspresję genów prozapalnych, co może przekładać się na poprawę regeneracji kości związanej z wiekiem.

Należy zauważyć pewne ograniczenia w obecnym badaniu. Jednym z nich jest fakt, że badacze jedynie wstępnie traktowali BM-MSC losartanem i fisetyną przed różnicowaniem, więc nie jest jasne, jaki byłby efekt ciągłego leczenia na różnicowanie trójliniowe. Potrzebne byłyby dalsze eksperymenty, aby zbadać, jak te leki wpływają na różnicowanie chondrogenne, chociaż wcześniejsze badania wykazały pozytywny wpływ losartanu in vivo na naprawę chrząstki. Badacze skupili się również tylko na skuteczności terapii na senescencję komórkową wywołaną ekspansją in vitro, a nie na innych przyczynach senescencji komórkowej, takich jak starzenie chronologiczne czy choroba.

Obiecujące wyniki wspierają zasadność przeprowadzenia badań in vivo z wykorzystaniem losartanu i fisetyny, samodzielnie lub w kombinacji, w celu poprawy gojenia złamań związanych z wiekiem. Wielokierunkowy pozytywny wpływ na regenerację kości mógłby zostać osiągnięty poprzez promowanie osteogenezy przy jednoczesnym zmniejszeniu senescencji komórkowej, stanu zapalnego, TGFβ i formowania osteoklastów. Można również przewidzieć zastosowania terapeutyczne, w których losartan i/lub fisetyna byłyby dostarczane w systemie o przedłużonym uwalnianiu dla zastosowań inżynierii tkankowej, podobnie jak w poprzednim badaniu, gdzie opracowano nanowłókna losartanu o przedłużonym uwalnianiu do utrzymania fenotypu chondrogennego.

Wyniki tego badania mają istotne implikacje kliniczne, szczególnie w kontekście starzejącej się populacji i rosnącej liczby przypadków osteoporozy oraz złamań kości. Terapia kombinowana losartanem i fisetyną może stanowić nową strategię poprawy regeneracji kości u pacjentów w podeszłym wieku, oferując jednocześnie bezpieczną alternatywę dla obecnie stosowanych metod leczenia.

Podsumowanie

Najnowsze badania nad regeneracją kości koncentrują się na synergistycznym działaniu losartanu i fisetyny na komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego. Substancje te wykazują znaczący potencjał w poprawie regeneracji tkanki kostnej poprzez stymulację osteogenezy bez zwiększania adipogenezy. Kombinacja losartanu w dawce 23,6 μM i fisetyny w dawce 50 μM skutecznie zmniejsza senescencję komórkową oraz ekspresję genów prozapalnych. Badania potwierdziły zwiększoną ekspresję wczesnych genów osteogenicznych, w tym fosfatazy alkalicznej i kolagenu typu 1A. Szczególnie istotne jest, że terapia nie powoduje wzrostu różnicowania adipogenicznego, co jest kluczowe w kontekście chorób związanych z wiekiem, takich jak osteoporoza. Wyniki badań otwierają nowe perspektywy terapeutyczne, szczególnie w kontekście starzejącej się populacji, choć konieczne są dalsze badania in vivo dla pełnego zrozumienia potencjału tej terapii.

Bibliografia

Nishimura Haruki, Murata Yoichi, Mullen Michael T., Yamaura Kohei, Singer Jacob, Huard Charles, Lind Dane R. G., Hambright William S., Bahney Chelsea S., Philippon Marc J. and Huard Johnny. Combination Therapy of Losartan and Fisetin Reduces Senescence and Enhances Osteogenesis in Human Bone Marrow–Derived Mesenchymal Stem Cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2025, 2025(6), 1576-1580. DOI: https://doi.org/10.1155/term/9187855.