Nanocząsteczki z losartanem przeciwko opornym zakażeniom MRSA pochwy

Czy MRSA stanowi wyzwanie, na które jesteśmy gotowi?

Zakażenia wywoływane przez oporne na metycylinę szczepy Staphylococcus aureus (MRSA) stanowią rosnący globalny problem zdrowia publicznego. MRSA tradycyjnie kojarzony z zakażeniami szpitalnymi, pojawia się również coraz częściej w środowiskach pozaszpitalnych, powodując szereg infekcji – od łagodnych zakażeń skóry i tkanek miękkich po poważne, zagrażające życiu stany, takie jak zapalenie płuc, wsierdzia, posocznica czy zespół wstrząsu toksycznego. Patogeny często kolonizują kanał rodny poprzez zanieczyszczenie kałowe, mogąc prowadzić do transmisji patogenu na noworodka podczas porodu, zwłaszcza po przedłużonym lub utrudnionym porodzie czy przedwczesnym pęknięciu błon płodowych, co czyni bakteryjną posocznicę noworodkową główną przyczyną zachorowalności w pierwszym tygodniu życia. Bakterie MRSA przenoszą się głównie poprzez tymczasowo zanieczyszczone ręce personelu medycznego, bezpośredni kontakt z zakażonymi zmianami oraz skażonymi powierzchniami. Typowymi miejscami kolonizacji są przednie nozdrza i pochwa, często również kolonizowana jest okolica krocza, rzadziej gardło i pachy. Zapalenie pochwy, objawowy stan zapalny charakteryzujący się wydzieliną, świądem i bólem, może zarówno wynikać z kolonizacji MRSA, jak i ją ułatwiać.

Kliniczny wpływ MRSA nasilił się ze względu na ograniczone opcje terapeutyczne przeciwko szczepom wielolekoopornym oraz zakażeniom związanym z tworzeniem biofilmu. W tym kontekście, repurposing leków niebędących antybiotykami, które wykazują aktywność przeciwbakteryjną in vitro, oferuje obiecującą strategię. Repurposing leków polega na wykorzystaniu istniejącego leku do nowych wskazań, wykraczających poza jego pierwotne zatwierdzenie. Podejście to korzysta z istniejących już danych farmakokinetycznych i bezpieczeństwa, co skraca czas rozwoju nowych terapii. Warto zauważyć, że leki przeciwpsychotyczne, takie jak promazyna, wykazały aktywność przeciwko MRSA, Klebsiella pneumoniae i innym patogenom poprzez zakłócanie integralności błony komórkowej, podczas gdy statyny (leki przeciwhiperlipidemiczne) mogą upośledzać żywotność Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumoniae poprzez promowanie dysfunkcji błony, apoptozy i hamowanie syntezy białek. Jednym z takich potencjalnych leków jest losartan potasowy (LOS) – znany lek przeciwnadciśnieniowy, który wykazuje również działanie przeciwbakteryjne.

Jakie technologie nanocząsteczkowe mogą przełamać bariery terapii?

MRSA może przetrwać wewnątrzkomórkowo, a powodzenie terapii przeciwdrobnoustrojowej zależy od tego, jak efektywnie leki przenikają do zakażonych tkanek i utrzymują się wewnątrz komórek. Zdolność leku do przekraczania błon komórkowych i pozostawania wewnątrzkomórkowo określa jego stężenie terapeutyczne w miejscu zakażenia. Nanonośniki (NCs) zwiększają przenikanie leków i ich akumulację w tkankach. W przypadku MRSA, bezpośrednia interakcja nanonośników z bakteriami, a następnie uwolnienie enkapsulowanego leku, ułatwia lepsze wchłanianie i trwałe działanie przeciwbakteryjne. Wśród różnych systemów nanonośników, szczególnie obiecujące są nanocząsteczki oparte na zeinie (ZNs). Zeina, naturalnie występujące hydrofobowe białko prolaminowe, służy jako biokompatybilny nośnik, który dodatkowo przyczynia się do wewnętrznych efektów przeciwdrobnoustrojowych. ZNs przyciągnęły znaczną uwagę ze względu na swoją biokompatybilność, biodegradowalność, przetwarzalność i zdolność do enkapsulacji zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych leków, przy jednoczesnym oferowaniu wyjątkowej stabilności koloidalnej. Ich wysoki stosunek powierzchni do objętości oraz wymiary w nanoskali zwiększają interakcje z płynami biologicznymi i promują efektywne wchłanianie komórkowe załadowanych leków. Wcześniejsze badania wykazały skuteczność przeciwdrobnoustrojową ZNs przeciwko Pseudomonas aeruginosa i Streptococcus mutans.

W opisywanym badaniu zastosowano Brij® – PEGylowany aktywator krawędziowy o zmiennej długości PEG i resztach kwasów tłuszczowych – do formułowania PEGylowanych nanocząsteczek zeiny (PZNs). Glikol polietylenowy (PEG) jest nienaładowanym, hydrofilowym polimerem szeroko stosowanym w formulacjach farmaceutycznych, szczególnie do zastosowań miejscowych i dopochwowych. PEGylacja zwiększa interakcję nanocząsteczek ze śluzem i nabłonkiem pochwy, poprawiając dystrybucję leku, retencję i skuteczność terapeutyczną. Połączenie właściwości penetrujących śluz PEG z ochronnym charakterem nanonośników umożliwia kontrolowane i zlokalizowane uwalnianie leku w pobliżu nabłonka pochwy.

Celem badania było zoptymalizowanie PZNs w celu zwiększenia dopochwowej dystrybucji i retencji losartanu oraz oceny ich bezpieczeństwa i skuteczności. Wykorzystując D-optimal mixture design, zbadano trzy czynniki formulacyjne: ilość Brij® (X₁), ilość zeiny (X₂) i typ Brij® (X₃), zdefiniowane jako krytyczne parametry procesu (CPPs), oraz zmierzono ich wpływ na wydajność enkapsulacji (EE%; Y₁), rozmiar cząstek (PS; Y₂) i potencjał zeta (ZP; Y₃), które reprezentują krytyczne atrybuty jakości (CQAs). Oceniono również wpływ przechowywania w czasie. Badania przenikania ex vivo porównywały roztwór LOS z optymalnymi PZNs, a mikroskopia konfokalna śledziła depozycję PZNs znakowanych fluoresceiną w tkankach pochwy. Testy in vitro oceniały aktywność przeciwbakteryjną, a eksperymenty in vivo na modelu mysim oceniały skuteczność terapeutyczną i bezpieczeństwo formulacji.

Jak zoptymalizować formulację nanocząsteczek dla maksymalnej efektywności?

Losartanem obciążone PZNs (LOS-PZNs) przygotowano metodą iniekcji etanolu. W skrócie, 100 mg fosfatydylocholiny (PC), zeinę i różne ilości Brij® O20 lub Brij® 93 rozpuszczono w 2 ml etanolu. Osobno 50 mg LOS rozpuszczono w 10 ml wody destylowanej i wstrzyknięto do roztworu lipofilowego przy mieszaniu magnetycznym w temperaturze 60°C i 1500 obr/min przez 30 minut, aby zapewnić całkowite odparowanie rozpuszczalnika. Powstałą dyspersję sonikowano przy użyciu sondy ultrasonicznej przy 40% amplitudzie przez łącznie 5 minut (3 s włączone/3 s wyłączone), aby poprawić jednorodność. Następnie formulacje przechowywano w temperaturze 4°C, aby umożliwić dojrzewanie.

Przebadano różne kombinacje ilości i typów składników, aby zidentyfikować optymalną formulację. Wydajność enkapsulacji wahała się od 45,49% do 90,54%. Stosunkowo wysoka EE% w tych formulacjach może być przypisana obecności PC, która zwiększa lepkość dyspersji pęcherzykowej. Ta podwyższona lepkość utrudnia dyfuzję leku z nanocząsteczek, poprawiając w ten sposób EE%. Analiza statystyczna przy użyciu ANOVA potwierdziła, że wszystkie testowane zmienne formulacyjne znacząco wpływały na EE%. Zwiększenie ilości Brij® początkowo skutkowało znacznym zmniejszeniem EE%, a następnie znacznym wzrostem przy wyższych stężeniach. Początkowy spadek może być przypisany zwiększonej rozpuszczalności leku i tworzeniu mieszanych miceli. Zwiększenie ilości zeiny prowadziło do spadku EE%, co można wytłumaczyć hydrofilowym charakterem LOS i fizykochemicznymi właściwościami zeiny, które mogą zmniejszać uwięzienie leku w hydrofobowej matrycy PZNs. Stosowanie Brij® 93 znacząco zwiększyło EE% w porównaniu do Brij® O20, co jest związane z wartościami równowagi hydrofilowo-lipofilowej (HLB) surfaktantów.

Rozmiar cząstek mieścił się w zakresie od 126,50 nm do 366,20 nm, co jest korzystne dla zwiększenia retencji cząstek w tkankach pochwy przy jednoczesnym minimalizowaniu ogólnoustrojowej absorpcji leku. Analiza statystyczna wykazała, że wszystkie testowane zmienne formulacyjne znacząco wpływały na PS. Zwiększenie ilości Brij® z 10 mg do 30 mg skutkowało znacznym zmniejszeniem PS, co można przypisać niewystarczającemu pokryciu surfaktantem przy niższych stężeniach, prowadzącemu do wyższego napięcia powierzchniowego i większych cząstek. Przy wyższych poziomach surfaktantu, zwiększona krzywizna nanocząsteczek i stabilizacja powierzchni prawdopodobnie przyczyniły się do zmniejszenia PS. Wyższe stężenie zeiny było związane ze spadkiem PS. Formulacje zawierające Brij® O20 wykazywały znacznie mniejszy PS w porównaniu do tych z Brij® 93, co można wytłumaczyć wyższą wartością HLB Brij® O20 (HLB = 15,3) w stosunku do Brij® 93 (HLB = 4,9), co zwiększa energię powierzchniową i zmniejsza PS.

Wartości potencjału zeta wynosiły od −26,93 mV do −46,85 mV, co wskazuje na dobrą stabilność koloidalną przygotowanych nanocząsteczek. Analiza statystyczna wykazała, że tylko typ Brij® miał znaczący wpływ na wartości ZP. Formulacje zawierające Brij® 93 wykazywały wyższe (mniej ujemne) wartości ZP w porównaniu do tych z Brij® O20, co można przypisać wyższej temperaturze przejścia (Tc) Brij® 93, która ułatwia tworzenie bardziej uporządkowanych i stabilnych struktur pęcherzykowych.

Optymalna formulacja PZN została wybrana przy użyciu oprogramowania Design-Expert®, które statystycznie analizowało wyniki wszystkich przygotowanych formulacji. Optymalizacja miała na celu maksymalizację EE% i ZP przy jednoczesnej minimalizacji PS. Wybrana formulacja osiągnęła wynik desirability 0,801, wskazujący na zadowalającą równowagę docelowych parametrów. Ta zoptymalizowana formulacja została przygotowana przy użyciu 30 mg Brij® O20 i 10 mg zeiny, dając EE% 90,58 ± 0,76%, PS 200,83 ± 0,27 nm, PDI 0,395 ± 0,006 i ZP −36,57 ± 0,54 mV.

Jakie mechanizmy uwalniania i penetracji leku determinują skuteczność terapii?

Badania uwalniania in vitro wykazały, że optymalne PZNs wykazywały początkowe szybkie uwalnianie (p = 0,001), a następnie znaczące, przedłużone uwalnianie w porównaniu z roztworem LOS. Różnorodne czynniki mogą wyjaśnić te odkrycia. Po pierwsze, LOS jest lekiem hydrofilowym z naturalnym powinowactwem do fazy wodnej, co przyczynia się do jego szybkiego początkowego uwalniania. Po drugie, obecność zarówno fosfolipidu, jak i zeiny w PZNs prawdopodobnie ułatwia ciągłe, przedłużone uwalnianie LOS, zapewniając zlokalizowany rezerwuar leku dla długotrwałej aktywności przeciwbakteryjnej.

Ocena strukturalna potwierdziła, że zoptymalizowana formulacja PZNs wykazywała jednolity rozkład wielkości z morfologią sferyczną. Po 3 miesiącach przechowywania w temperaturze 4°C, optymalne PZNs zachowały swoje kluczowe właściwości fizykochemiczne. Nie zaobserwowano znaczących różnic w EE% (89,00 ± 0,20%), PS (210,00 ± 2,00 nm), PDI (0,380 ± 0,010) czy uwalnianiu leku po 6 godzinach (Q6h: 60,00 ± 2,00%) (p > 0,05). Obserwowana stabilność może być przypisana obecności składników stabilizujących, takich jak PC, zeina i surfaktanty PEGylowane, które pomagają utrzymać integralność cząstek, zapobiegać agregacji i zachować enkapsulację leku w czasie.

Badania przenikania ex vivo wykazały, że optymalne LOS-PZNs wykazywały znacznie mniejszą dyfuzję przez błonę śluzową pochwy w porównaniu z roztworem LOS (p < 0,05). Obliczone wartości strumienia przenikania (Jss) wynosiły 73,91 μg/cm²/h dla roztworu LOS i 64,65 μg/cm²/h dla optymalnych PZNs, podczas gdy odpowiednie współczynniki przenikania wynosiły 0,014 i 0,012. Odkrycia te są zgodne z zaleceniem podkreślającym znaczenie ograniczenia ogólnoustrojowej absorpcji leku w celu poprawy leczenia zakażeń pochwy przy jednoczesnym minimalizowaniu ogólnoustrojowych efektów ubocznych. Zmniejszona przepuszczalność obserwowana przy optymalnych PZNs może być przypisana obecności PC i zeiny, które efektywnie enkapsulują LOS i zapewniają przedłużone, kontrolowane uwalnianie leku. Dodatkowo, wcześniejsze badania wykazały, że zeina może działać jako matryca depot, promując przedłużone uwalnianie leku. Warto zauważyć, że ilość LOS zdeponowanego z roztworu LOS wynosiła 1178,96 ± 193,55 μg, podczas gdy depozycja z optymalnych PZNs była znacznie wyższa i wynosiła 2304,46 ± 56,44 μg.

Obrazy z konfokalnej mikroskopii skaningowej laserowej (CLSM) wykazały zwiększoną internalizację komórkową i zwiększone przenikanie leku do wielu warstw tkanki pochwy. Tkanki pochwy traktowane fluorescencyjnie znakowanymi optymalnymi PZNs wykazywały głęboką penetrację barwnika do warstw pochwy, wskazując na efektywną dystrybucję nanocząsteczek i akumulację w głębszych tkankach. Odkrycia te sugerują, że optymalne PZNs mogą ułatwić poprawę dostarczania leków w leczeniu zakażeń pochwy związanych z MRSA.

Jakie dowody potwierdzają kliniczną skuteczność LOS-PZNs?

LOS wykazał aktywność przeciwbakteryjną przeciwko MRSA USA300, z wartościami MIC i MBC odpowiednio 5 mg/ml i 10 mg/ml. Aktywność przeciwbakteryjna in vivo roztworu LOS i optymalnej formulacji LOS-PZN została oceniona przy użyciu mysiego modelu zakażenia pochwy MRSA. Trzy grupy samic szczurów Wistar (n = 6) zostały dopochwowo zakażone zawiesiną MRSA USA300. Zarówno roztwór LOS, jak i optymalna formulacja LOS-PZN znacząco zmniejszyły obciążenie bakteriami MRSA odzyskanymi z zakażonych pochw w porównaniu z grupą kontrolną negatywną (bez leczenia) we wszystkich testowanych punktach czasowych (p < 0,05). Optymalna formulacja LOS-PZN wykazała znacznie większą aktywność przeciwbakteryjną in vivo niż roztwór LOS we wszystkich ocenianych punktach czasowych (p < 0,05). W szczególności liczba bakterii w grupie leczonej optymalną formulacją była o 3,866, 4,332 i 5,327 jednostek logarytmicznych niższa niż w grupie kontrolnej odpowiednio w 1., 2. i 3. dniu po zakażeniu. Dla porównania, grupa leczona roztworem LOS wykazała zmniejszenie o 2,531, 2,799 i 3,260 jednostek logarytmicznych w tych samych dniach. Co godne uwagi, pod koniec eksperymentu (dzień 3 po zakażeniu) nie wykryto wzrostu bakterii u trzech z sześciu szczurów leczonych optymalną formulacją losartanu.

Badanie mikroskopowe próbek pochwy szczurów wykazało, że w przypadku normalnej grupy kontrolnej normalnie zorganizowane struktury histologiczne ściany pochwy, w tym widoczne nienaruszone pokrywające warstwy nabłonka wielowarstwowego płaskiego, nienaruszone warstwy tkanki łącznej podśluzówkowej bez nieprawidłowych nacieków, a także nienaruszony zewnętrzny płaszcz mięśniowy. Kontrola pozytywna (zakażone próbki nieleczone) wykazała zanik nabłonka pochwy z łagodnym obrzękiem w blaszce właściwej. W odniesieniu do grupy leczonej roztworem, wykazała ona mikrofotografię pokazującą przekrwienie naczyń krwionośnych w blaszce właściwej (barwienie hematoksyliną i eozyną). Ponadto grupa leczona PZN wykazała znaczącą skuteczność ochronną z bardziej zorganizowanymi cechami morfologicznymi ściany pochwy, w tym widocznym nienaruszonym pokryciem nabłonka bez nieprawidłowych zmian mikroskopowych i nienaruszonych warstw podśluzówkowych bez nieprawidłowych nacieków.

Podsumowując, losartanem obciążone PZNs zostały z powodzeniem opracowane przy użyciu metody iniekcji etanolu, z optymalizacją formulacji przeprowadzoną za pomocą podejścia D-optimal mixture design. Optymalna formulacja wykazała sferyczną morfologię z korzystnymi właściwościami, w tym wysoką EE%, doskonałym PS, niskim PDI i odpowiednimi wartościami ZP. Dodatkowo, optymalne PZNs wykazały dobrą stabilność fizyczną. CLSM potwierdziła efektywną depozycję PZNs w warstwach pochwy, podczas gdy badania ex vivo ujawniły przedłużony profil uwalniania leku. Badania in vivo dodatkowo potwierdziły skuteczność terapeutyczną LOS-PZNs przeciwko zakażeniom MRSA. Ponadto, oceny histopatologiczne wykazały bezpieczeństwo i skuteczność optymalnych PZNs. Łącznie wyniki te potwierdzają potencjalne zastosowanie PZNs jako skutecznego przeciwbakteryjnego systemu nanonośnikowego w leczeniu zakażeń pochwy związanych z MRSA.

Podsumowanie

Zakażenia wywołane przez oporne na metycylinę szczepy Staphylococcus aureus (MRSA) stanowią rosnący problem zdrowia publicznego, szczególnie w kontekście zakażeń pochwy i transmisji na noworodki podczas porodu. W obliczu ograniczonych opcji terapeutycznych wobec szczepów wielolekoopornych, repurposing leków niebędących antybiotykami oferuje obiecującą strategię leczenia. Badanie przedstawia innowacyjne podejście wykorzystujące losartan potasowy – znany lek przeciwnadciśnieniowy wykazujący właściwości przeciwbakteryjne – w postaci PEGylowanych nanocząsteczek zeiny (PZNs). Zastosowanie technologii nanocząsteczkowych znacząco poprawia dostarczanie leku do tkanek pochwy, zwiększając jego retencję i skuteczność przy jednoczesnym minimalizowaniu absorpcji ogólnoustrojowej. Optymalna formulacja, opracowana metodą D-optimal mixture design, osiągnęła wysoką wydajność enkapsulacji (90,58%), odpowiedni rozmiar cząstek (200,83 nm) i stabilność koloidalną. Badania ex vivo potwierdziły przedłużone uwalnianie leku oraz trzykrotnie wyższą depozycję w tkankach pochwy w porównaniu z roztworem losartanu. Eksperymenty in vivo na modelu mysim wykazały, że losartanem obciążone PZNs znacząco zmniejszyły obciążenie bakteryjne MRSA, osiągając redukcję o ponad 5 jednostek logarytmicznych w trzecim dniu po zakażeniu, przy czym u połowy leczonych zwierząt nie wykryto wzrostu bakterii. Analiza histopatologiczna potwierdziła bezpieczeństwo terapii i ochronne działanie na struktury tkanki pochwy. Wyniki badania potwierdzają, że PEGylowane nanocząsteczki zeiny z losartanem stanowią skuteczny i bezpieczny system nanonośnikowy w leczeniu zakażeń pochwy związanych z MRSA, oferując alternatywę dla konwencjonalnej antybiotykoterapii.